正相色譜vs反相色譜

現(xiàn)代液相色譜中,分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇.但是色譜填料的選擇范圍很寬,要做合適的選擇,必須對此有一定的認(rèn)識和了解.

1,正相色譜
正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica）,以及其他具有極性官能團(tuán),如胺基團(tuán)  （NH2,APS）和氰基團(tuán)（CN,CPS）的鍵合相填料.
由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他團(tuán)的極性較強(qiáng),因此,分離的次序是依據(jù)樣品 中的各組份的極性大小,即極性強(qiáng)弱的組份zui先被沖洗出色譜柱. 正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低,如:正乙烷（Hexane）,氯仿（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等.

2,反相色譜
反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ),表面鍵合有極性相對較弱的官能團(tuán)的鍵合相. 反相色譜所使用的流動相極性較強(qiáng),通常為水,緩沖液與甲醇,已腈等混合物. 樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)組合zui先被沖出,而極性弱的組份會在色譜柱上有 更強(qiáng)的保留. 常用的反相填料有C18（ODS）,C8（MOS）,C4（B）,C6H5（Phenyl）等.
二,聚合物填料
聚合物調(diào)料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等,其主要優(yōu)點(diǎn)是在PH值為1～ 14均可使用. 相對與硅膠基質(zhì)的C18填料,這類填料具有更強(qiáng)的疏水性;大孔的聚合物填料對蛋白 質(zhì)等樣品的分離非常有效. 現(xiàn)在的聚合物填料的缺點(diǎn)是相對硅膠基質(zhì)填料,色譜柱柱效較低.
三,其他無機(jī)填料
其它HPLC的無機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化.由于其特殊的性質(zhì),一般于特殊的 用途.如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料.這種填料的分離不同與硅膠基質(zhì)烷基 鍵合相,石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ),不再需其它的表面改性,該柱填料一般比烷基 鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng),石墨化碳可用于分離某些幾何導(dǎo)構(gòu)體,又由 于HPLC流動相中不會被溶解,這類柱可在任何PH與溫度下使用.氧化鋁也可用于HPLC, 氧化鋁微粒剛性強(qiáng),可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床,其優(yōu)點(diǎn)是可在PH高達(dá)12的流動相中使用. 但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強(qiáng),應(yīng)用范圍受到一定的限制,所以未能廣泛應(yīng)用, 新型氧化鋯填料也可用于HPLC,商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱,應(yīng) 用PH范圍1～14,溫度可達(dá)100℃.由于氧化鋯填料幾年才開始研究,加之面臨的實(shí)驗(yàn)難 度,其重要用途與優(yōu)勢尚在進(jìn)行中.
怎樣選擇填料粒度
目前,商品化的色譜料粒度從1um到超過30um均有銷售,而目前分析分離主要用3um, 5um和10um填料,填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù),即柱效和背壓.粒度越小,填 充柱的柱效越高;小于3um的填料應(yīng)用,在相同選擇性條件下,提高柱效可提高分離度, 但不是*的因素.如果固定相選擇是正確,但是分離度不夠,那么選擇更小粒度的填料 是很有用的,3um填料填充柱的柱數(shù)比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而, 3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍.與此同時,柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更 短的色譜柱,以縮短分析時間,另外,可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使 用溫度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色譜柱的壓力.





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